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免疫组化标准方案 (福尔马林固定石蜡包埋)

1. 实验材料

(1) PBS

(2) Clearing and rehydration试剂:Histoclear II、100%、90%和70% 酒精

(3) 热诱导表位恢复试剂试剂(Heat induced epitope retrieval; HIER):10mM柠檬酸钠,PH6.0

(4) 抗原恢复试剂(Antigen retrieval):蛋白酶K和胰蛋白酶

(5) 内源性过氧化酶封闭液:0.3%H2O2

(6) 封闭液:含10%FBS的PBS,FBS种属与二抗来源种属一致

(7) 一抗:纯化或生物素化规格(供二步法使用)

(8) 二抗:生物素化。(供三步法用)

(9) 放大剂:抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(cat#18-4100)

(10) 显色剂:30% H2O2储液,二氨基联苯胺(DAB)1%储液。

(11) 细胞核复染试剂:苏木素(Hematoxylin)

(12) 包埋剂:封盖胶(Fisher Scientific)

2. 实验方案

(1) 石蜡包埋,切片。

(2) 50-60度烤箱中干燥烘烤20分钟(注意:温度不能超过60度以免破坏靶抗原)。

(3) 对载玻片进行如下洗涤和孵育程序,以除去石蜡和水化:Histoclear II 3 x 5 分钟, 100% Ethanol 2 x 5 分钟, 90% Ethanol 1 x 5 分钟, 70% Ethanol 1 x 5 分钟, ddH2O 1 x 5 分钟(注意:充分浸入,除去气泡,避免组织过分干燥以免影响后续染色)。注:若抗原在固定时容易交联(影响一抗的特异性),则需要蛋白酶消化或枸橼酸盐缓冲液中加热除去交联。抗原修复方法依照靶抗原选择,建议没有修复的和修复后的抗原同时进行。

(4) (可选)热修复抗原表位(HIER):将玻片完全浸没于修复液中,微波加热煮沸15min,再置于枸橼酸盐缓冲液中冷却至室温。

(5) (可选)抗原修复(蛋白消化法):将玻片浸入蛋白酶K或胰蛋白酶中,37度孵育20min,冷却至室温。

(6) 用 PBS小心洗涤两次,每次5分钟,浸没,低速摇晃。

(7) 如果最后要使用过氧化物酶显影,则将玻片浸入0.3%H2O2中室温15-40min,除去过氧化物酶。注意:个别组织孵育时间依照过氧化物酶含量调整。

(8) 用 PBS小心洗涤三次,每次5分钟,浸没,低速摇晃。

(9) 用10%的正常血清封闭组织上非特异性位点,100-150ul/slide,室温封闭1小时,为防止封闭液蒸发,可以使用石蜡封口膜轻轻覆盖切片,避免拉伸和产生气泡,置然后于湿盒中。

(10) 用镊子小心的除去封口膜,将玻片用 PBS小心洗涤1次,每次5分钟,浸没,低速摇晃。

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