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eFluor® 纳米晶体免疫荧光染色(冰冻切片)

1. 材料:

(1) TBS(Tris buffered saline):5mM Tris,150mM Nacl,PH 7.4。
(2) 丙酮:分析纯
(3) 封闭液:含10%FBS或1%BSA的TBS,FBS种属与二抗来源种属一致。
(4) 一抗:纯化或生物素化规格。
(5) 二抗:生物素化。
(6) 显色剂:抗生物素的eFluor 605NC(CAT#93-2317)或抗生物素的eFluor 650NC(CAT#95-2317)。
(7) 包埋剂:Fluoromount-G(southernBiotech)or Fluoro-Gel(EMS)。
(8) 湿盒。


2. 方案:

(1) 切片空气干燥10min。
(2) 浸入丙酮固定10min。
(3) TBS室温水化10min。注意:组织不能脱水,否则不利于染色。
(4) 室温封闭1小时(100ul/组织),盖膜防止蒸发。注意:PAP笔可能会干扰eFluor荧光在此不建议使用。
(5) 用镊子小心移去膜,TBS,慢速振荡洗涤3次,每次5min。
(6) 用封闭液按照说明书稀释一抗,加一抗湿盒中室温孵育2小时。低丰度的抗原一般4度孵育12小时以上。
(7) TBS洗3次,方法同上。
(8) 按建议浓度稀释二抗,室温孵育1小时。
(9) TBS洗3次,方法同上。
(10) 按建议浓度(1:100)稀释显影剂:抗生物素的eFluor 605NC(CAT#93-2317)或抗生物素的eFluor 650NC(CAT#95-2317)。室温避光孵育30min。
(11) TBS洗3次,方法同上。
(12) 封片,4度避光保存或直接观察拍照。

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