1. 实验材料：

(1) TBS和PBS。

(2) 固定液：4%甲醛或100%冰预冷甲醇。

(3) 破膜剂：（PBS配至，W/V）

(4) 封闭液：含10%FBS的 TBS，FBS种属与二抗来源种属一致；0.1%Triton X-100

(5) 一抗：纯化级或生物素级别。

(6) 二抗：抗生物素的（三步法）或直标的（二步法）。

(7) 显色剂：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）或抗生物素的FITC（CAT#11-4317）

(8) 包埋剂：Fluoromount-G（southernBiotech）or Fluoro-Gel（EMS）。

(9) 湿盒。

2. 实验步骤：

(1) 制备细胞涂片或爬片，细胞密度要适当。

(2) 用4%甲醛室温固定细胞15min或用100%甲醇-20度固定10min。

(3) PBS洗涤3次，每次5min。吸管滴加和吸取。注意：避免细胞干燥，以免增加非特异背景。

(4) 破膜剂破膜，盖封口膜防止蒸发，湿盒室温孵育10min后，37度孵育30min。

(5) PBS洗涤3次，每次5min。吸管滴加和吸取。

(6) 封闭液封闭细胞，每一小格100ul，（8格玻片）室温湿盒孵育1小时。

(7) 小心移去封口膜，PBS洗涤3次，每次5min。吸管滴加和吸取。

(8) 用封闭液按照说明书稀释一抗，加一抗湿盒中室温孵育2小时。低丰度的抗原一般4度孵育12小时以上。

(9) TBS，慢速振荡洗涤3次，每次5min。如果是未结合的一抗继续步骤10（一步法）；如果是生物素化的一抗则跳到步骤12。

(10) 按照说明书稀释抗生物素或荧光标记的二抗，盖膜，室温湿盒孵育1小时。注意：如果二抗是结合荧光素的，则需要避光并且去掉封闭液中的Triton X-100。

(11) TBS洗三次，方法同上。

(12) 按建议浓度（1:100）稀释显影剂：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）或抗生物素的FITC（CAT#11-4317）。室温避光孵育30min。

(13) TBS洗3次，方法同上。

(14) 封片，4度避光保存或直接荧光显微镜观察拍照。