细胞表面分子流式检测步骤说明注意事项

1． 在使用抗体之前，快速甩动一下，使之聚集到管的底部；

2． 荧光标记的抗体应该避光保存在4℃，不要冷冻；

3． 当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。

过程概述：

1． 制作外周血、淋巴组织或者培养细胞的单细胞悬液；

2． 细胞染色抗体（包括直接标记抗体和间接标记抗体）；

3． 洗涤步骤弃掉所有的为束缚的试剂

4． 运行分析流式仪。

注意：流式细胞染色实验中，所有实验条件的优化都很重要。关键参数包括靶细胞、抗体效价以及动力学。

试验A：小鼠淋巴细胞悬液的免疫荧光染色

材料：12×75 mm的圆底试管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圆底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗体（既未纯化也未偶联），

缓冲液： eBioscience流式染色缓冲液（Cat.No.00-4222），流式鞘液

仪器：移液管和移液器，离心机，冰柜或冰箱，流式仪

试验时间

半个小时细胞准备，半个小时抗体稀释和样品准备，半个小时到一个小时孵育过程，半个小时以上的运行和分析时间

方法细胞准备：

1． 采集组织（脾，淋巴结，胸腺），用注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；

2． 转移到50ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；

3． 4℃ 离心沉淀细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清；

4． 如果上过程采集的脾，还用用RBC裂解，否则进入下一步；

5． 用50ml染色液重悬样本，进行细胞计数和活力分析；

6． 再次离心细胞，弃掉上清，重悬细胞使其细胞数达到2×107 个/ml；

抗体的准备和孵育：

1． 用50 ?l染色液稀释前面选的抗体，分装到每个试管或微量滴定板的孔中。吸取50 ?l染色液到阴性对照试管中。在滴定实验中，滴定范围是2-0.03?g/百万个细胞；

2． 加入50 ?l细胞悬液（相当于106个细胞）于每个试管或孔中，轻轻混匀；

3． 避光冰浴20分钟。注意：某些抗体可能需要更长的孵育时间，用预实验摸索实验条件；

4． 孵育之后，加入染色液(试管2ml，微量滴定板200?l)；

5． 4℃ 离心沉淀细胞5分钟（300-400g），吸掉上清；

6． 再重复洗2次；

7． 重悬已染色的细胞沉淀物，到流式细胞仪上分析。

a.如果用荧光标记的抗体，用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。

b.如果用纯化的或者生物素标记的抗体，加入合适的50-100?l染色液（偶联荧光染料的第二抗体或抗生物素蛋白）于每个样品中。避光冰浴15-30分 钟，按步骤4和5洗2次。用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。细胞染色法区分活细胞和死细胞。

注意：如果同时加入多种荧光标记的抗体进行染色，孵育和洗涤的步骤和上面的一样。注意加入荧光抗体后的所有步骤都要在低温避光的条件下进行。

试验B: 人类外周血的免疫荧光染色材料　　

12×75 mm的试管（Falcon Cat.No.2008）　　

抗体（未偶联或偶联荧光）　　

第二试剂，如果用间接染色缓冲液　　

eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4222）　　

鞘液　　

eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（Cat.No.00-4333）

设备　　

移液管和移液器　　

离心机　　

冰柜或冰箱　　

流式仪试验时间半个小时抗体稀释和样品准备半个小时到一个小时染色过程半个小时以上的运行和分析时间方法

1． 用50?l染色液稀释未偶联或偶联生物素的抗体，分装到每个试管中。分装50?l染色液到干净的或阴性对照试管中。滴定ioscience抗人的偶联荧光素的抗体20?l于每个样品中；

2． 加100?l 全血到每个试管中，轻轻混匀；

3． 避光室温孵育15-30分钟。注意：某些抗体结合力较低可能需要更长的孵育时间。预试验摸索这些条件。

4． 加2ml 1×RBC（预温到室温）于每个试管中，轻轻混匀；

5． 避光室温孵育样品10分钟。用1×RBC 孵育不要超过15分钟。

6． 室温离心样品（300-400g），抽吸掉上清液，然后用2ml 染色液洗一次。

7． 重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析样品。

a. .如果用荧光标记的抗体，用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。

b. .如果用纯化的或者生物素标记的抗体，加入合适的50-100?l染色液（偶联荧光染料的第二抗体或抗生物素蛋白）于每个样品中。避光冰浴15-30分 钟，按步骤4和5洗2次。用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。细胞染色法区分活细胞和死细胞。

注意：如果同时加入多种荧光标记的抗体进行染色，孵育和洗涤的步骤和上面的一样。注意加入荧光抗体后的所有步骤都要在低温避光的条件下进行。