Flow Cytometry

流式分析样品的准备

流式一、

样品的准备

试验一:组织培养细胞的细胞准备

材料   

AccutaseTM Enzyme Cell 完全培养基(eBioscience Cat.No. 00-4555)  流式细胞仪染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  15或50ml尖底离心管

实验过程

1. 对于悬浮培养的细胞,把细胞分装到一个尖底离心管中,对细胞进行计数和活性分析,然后进入步骤3;

2. 对于贴壁培养的细胞,建议用AccutaseTM Enzyme Cell 完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物,然后把细胞分装到一个尖底离心管中,对细胞进行计数和活性分析,进入步骤3;

3. 离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。

试验二:淋巴组织的细胞准备

材料  

60×15 mm 组织培养皿  

3 ml注射器  

细胞滤网(血液尼龙滤网)  

流式细胞仪染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底离心管

实验过程

1. 采集组织(采集组织(脾,淋巴结,胸腺)放进一个细胞培养皿中,用3 ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液,此过程用10ml的染色缓冲液;

2. 加入10ml染色液收集细胞,使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片,收集细胞悬液于尖底离心管中;

3. 4℃离心细胞悬液4-5分钟(300-400g),弃掉上清液;

4. 重悬细胞沉淀,细胞计数和活性分析;

5. 按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞,使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验三:非淋巴组织的细胞制备

材料  

剪刀或者手术刀片  

PBS   

60×15 mm 组织培养皿  

3 ml注射器  

细胞滤网(血液尼龙滤网)  

流式细胞仪染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底离心管  

实验过程

1. 采集组织,用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块;

2. 按照酶的使用说明书,加入适量用PBS稀释的酶,孵育。酶的选择可以参照以下网站:http://www.tissuedissociation.com;

3. 用移液管轻轻吹散细胞,并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片;

4. 4℃离心细胞悬液4-5分钟(300-400g),弃掉上清液;

5. 用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液;

6. 重复步骤4;

7. 重复步骤5和6;

8. 用流式染色液重悬细胞沉淀,细胞计数和活性分析;

9. 按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞,使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验四:

材料  

PBS   

FicollTM或其它的培养基  

流式细胞仪染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底离心管实验过程

1. 在尖底离心管中用PBS按1:1的比例稀释血样;

2. 用FicollTM 等倍稀释样品;

3. 离心20分钟;

4. 收集PBS和FicollTM交界处的PBMC;

5. 在试管中加入PBS;

6. 4℃离心细胞悬液4-5分钟(300-400g),弃掉上清液;

7. 用流式染色液重悬细胞沉淀,细胞计数和活性分析;

8. 按照步骤6离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞,使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。   

用淋巴组织细胞悬液在流式细胞仪上分析以前,最好去掉红细胞。

试验一:鼠脾细胞中红细胞的裂解:

材料  

1×PBS   

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 采集小鼠的脾脏并且制成单细胞悬液;

2. 4℃ 离心沉淀细胞(300-400g),弃掉上清液;

3. 用5ml脾的红细胞裂解液重悬细胞;

4. 室温震荡孵育4-5分钟(也可在冰上进行);

5. 加入20-30ml PBS 停止反应;

6. 4℃ 离心沉淀细胞(300-400g),然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀,继续下一步试验;

7. 细胞计数。

试验二:小鼠血液的红细胞裂解

材料  

1×PBS   

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 1ml小鼠血液中加入10ml 红细胞裂解液;

2. 室温震荡孵育4-5分钟(也可在冰上进行);

3. 加入20-30ml PBS 停止反应;

4. 4℃ 离心沉淀细胞(300-400g),然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀,继续下一步试验;

5. 细胞计数。

试验三:人外周血中红细胞的裂解

材料  

1×PBS   

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 1ml人的血液中加入10ml 红细胞裂解液;

2. 室温孵育10分钟(不要超过15分钟);

3. 加入20-30ml PBS 停止反应;

4. 4℃ 离心沉淀细胞(300-400g),

然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀,继续下一步试验;

5. 细胞计数。

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