流式胞内蛋白染色，很关键的一点是需要知道要染的蛋白在哪个位置，这样才能选对操作流程和buffer体系。例如，核内蛋白和大部分分泌蛋白要用eBioscience 的Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523)，而像细胞因子和趋化因子这类分泌蛋白要用Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set (eBioscience Cat. No. 88-8824)。对于磷酸化信号通路蛋白，不能用以上两种buffer体系，而要用Fixation/Methanol Protocol。

 

eBioscience针对流式胞内染色推出了三种解决方案：

方案A：两步法胞内蛋白染色（细胞质），用于检测可以通过体内或体外激活的单个细胞的胞浆蛋白、细胞因子或其他的分泌蛋白。

方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核），用于检测核内蛋白，如转录因子。

方案C：两步法Fixation/Methanol，用于检测磷酸信号分子，如MAPK和STAT蛋白等。

 

注意：

1、  流式抗体要避光储存于2-8°C，严格避免反复冻融。

2、  使用抗体前，快速旋转使抗体恢复到最大体积，不建议斡旋混匀抗体。

3、  除操作说明外，所有的染色步骤一律在冰上或4℃避光操作。

4、  缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。

5、  固定和透化作用将影响eFluor纳米晶体的亮度，建议使用最短的固定和透化作用时间，染色后立即上机检测分析。

 

方案A: 两步法胞内蛋白染色（细胞质）

实验材料：
12×75mm圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor®450,506,660, or 780 (eBioscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)
胞内抗原的直标抗体。
胞内Fixationand Permeabilization Buffer Set(eBioscienceCat. No. 88-8824)，稀释到1x使用
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

刺激剂：CellStimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500X)(eBioscience Cat.No. 00-4975) or ProteinTransport Inhibitor Cocktail(500X) (eBioscience Cat. No.00-4980) or Brefeldin ASolution (eBioscience Cat.No. 00-4506) or MonensinSolution (eBioscience Cat. No. 00-4505)

实验流程： 
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。

2、按照流式表面染色方法标记细胞表面抗原，缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。

3、加100ul ICFixationbuffer ，斡旋固定细胞，室温避光孵育20-60min。

4、每管加2ml1×permeabilization buffer，300-400xg室温离心5min，弃上清。

5、每管加2ml1×permeabilization buffer重悬细胞，300-400xg室温离心5min，弃上清。

6、每管加100ul1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入检测胞内抗原的抗体，室温避光孵育20-60min。
7、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室温离心5min，弃上清。
8、每管加2ml FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室温离心5min，弃上清。
9、每管适量流式染色液重悬即可上机检测，同行对照依照上述步骤进行。

 

方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）

实验材料：
12×75mm圆底检测流式管或96孔尖底或圆底微孔板。
[可选]FixableViability Dyes eFluor 450, 506,660 and 780(eBioscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)

胞内抗原的直标抗体。
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523) 
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

实验流程一（试管）
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记细胞表面抗原。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、每管加1mlFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。
4、每管加2ml1×permeabilizationbuffer，300-400xg室温离心5min，弃上清。
5、每管加2ml1×permeabilizationbuffer重悬细胞，300-400xg 室温离心5min,弃上清。
6、每管加100ul1×permeabilizationbuffer重悬细胞。

7、可选：每管加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封闭，室温孵育15分钟。

8、每管加入荧光标记抗体，室温避光孵育30min。
9、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室温离心5min，弃上清。
10、每管加2ml1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室温离心5min，弃上清。
11、每管加适量FlowCytometry Staining Buffer重悬细胞，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。

实验流程二（96孔微孔板）

1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记细胞表面抗原。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、每孔加200 µLFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。300-400xg室温离心5min，弃上清。，

4、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer，300-400xg 室温离心5min,弃上清。

5、重复步骤4。
6、每孔加100ul1×permeabilizationbuffer重悬细胞

7、可选：每孔加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封闭，室温孵育15分钟。

8、每孔加入荧光标记抗体，室温避光孵育30min。
9、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室温离心5min，弃上清。
10、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室温离心5min，弃上清。
11、每孔加适量Flow CytometryStaining Buffer重悬细胞，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。

 

方案C：两步法Fixation/Methanol

实验材料：
12×75mm 圆底检测流式管或96孔尖底或圆底微孔板。
胞内抗原的直标抗体

eBioscienceFlowCytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)

eBioscienceICFixation Buffer (cat. 00-8222)

90-100% 甲醇(HPLC 级)

可选Fc Block：Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(eBioscienceCat. No. 14-0161) or Human Fc ReceptorBinding Inhibitor Purified(eBioscienceCat. No. 14-916 ）

实验流程

1、准备刺激细胞的刺激剂，用刺激剂重悬细胞使细胞浓度达1-5x106cells/mL，37℃培养一段时间（刺激时间依样品而定）。取未刺激的细胞同样处理作为阴性对照。

2、固定细胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到细胞里，斡旋混匀，室温，避光孵育10-60min。

3、室温600xg离心4-5min，弃上清。

4、重悬细胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，涡旋混匀，4℃或冰上孵育至少30min。

注意：细胞加了甲醇，可以在<-20℃条件下保存超过4周。

5、用FlowCytometryStaining Buffer洗涤细胞，室温600xg离心4-5min，弃上清。

6、用 FlowCytometryStaining Buffer重悬细胞，将细胞浓度调至1x10⁷cells/mL 。

7、取100 μL(1x106cells)细胞到流式管。

8、可选：染色前可以使用MouseCD16/ CD32抗体或人类Fc受体抑制非特异性结合。

9、加荧光标记抗体，室温避光孵育30-60min。

注意：如果需要，表面染色和胞内磷酸染色可以同时进行，因为不是所有的抗体克隆号都结合到一个固定位点，请查阅固定和甲醇处理后细胞染色的抗体克隆号表。

10、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗涤细胞，室温600xg离心4-5min，弃上清。重复一次。

11、用适量的FlowCytometryStaining Buffer 重悬细胞后上机检测。同行对照依照上述步骤进行。

 

实验流程（96孔微孔板）

1、准备刺激细胞的刺激剂，用刺激剂重悬细胞使细胞浓度达1-5x106cells/mL，

2、取96孔微孔板，每孔加100μL刺激剂，再加100 μL细胞，37℃培养一段时间（刺激时间依样品而定）。取未刺激的细胞同样处理作为阴性对照。

3、固定细胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到细胞里，斡旋混匀，室温，避光孵育10-60min。

4、室温600xg离心4-5min，弃上清。

5、重悬细胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，涡旋混匀，4℃或冰上孵育至少30min

注意：细胞加了甲醇，可以在<C的条件下保存超过4周。°-20

6、用200 μLFlowCytometry Staining Buffer 洗涤细胞，室温600xg离心4-5min，弃上清。重复一次。

7、可选：染色前可以使用Mouse 的CD16/CD32纯化抗体或人类Fc受体抑制分特异性结合。

8、加荧光标记抗体，室温避光孵育30-60min。

注意：如果需要，表面染色和胞内磷酸染色可以同时进行，因为不是所有的抗体克隆号都结合到一个固定位点，请查阅固定和甲醇处理后细胞染色的抗体克隆号表。

9、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗涤细胞，室温600xg离心4-5min，弃上清。重复一次。

10、用适量的FlowCytometryStaining Buffer 重悬细胞后上机检测。同行对照依照上述步骤进行。