ELISA

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Platinum ELISA 参考实验方法

(以BMS606 mouse IFN-gamma ELISA为例)

注意事项:

1. 试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体,不建议不同试剂盒产品调换,因为可能影响结果准确性。
2. 稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠,因为其可以灭活辣根过氧化物酶。
3. 储存或孵育时避开强光。
4. 注意人员防护,避免试剂接触皮肤。
5. 底物溶液避免接触氧化剂和金属。
6. 底物使用前请平衡至室温。
7. 缓冲液稀释后有效期为一个月,放大液现用现配(配好立即加到板子中)。

储存和稳定性说明
1. 试剂盒提供冻结的标准品,对照干粉和平板,收到后请存于4~8度冰箱,有效期见标签。
2. 重复使用试剂请避免污染。

样品及收集注意事项
1. 本试剂盒适用血清和细胞培养上清。
2. 取血清时注意凝结后立即取出血清冻存于-20摄氏度一下,避免IFN-gamma活性降低。
3. 样品出现沉淀请离心去除,避免影响实验结果。
4. 严重溶血或高血脂样品不能使用。
5. 避免样品反复冻融,使用前平衡至室温,小心混匀。

试剂准备:
1. 1×Washing buffer:50ml 20×washing buffer concentrate+950ml ddH2O 混合均匀,4~25摄氏度保存一个月。
2. Assay buffer 用水稀释为1×。
3. 用1×assay buffer 稀释biotin-检测抗体100:1.
4. 用1×assay buffer 稀释streptavidin-HRP 100:1

标准品稀释(如下图)
1. 按照C of A说明使用无菌双蒸水配制浓度为2ng/ml 的标准品溶液,四度平衡混匀10—30min。
2. 使用1xAssay Buffer按如下方案稀释(1:2)
小心混匀,终浓度为1000pg/ml.

 

3. 在ELISA板子中从A1和A2开始到H1和H2每孔分别加入100ul检测稀释液。
4. 取100ul的浓度为2000pg/ml的标准品加入到A1和A2两个孔中。
5. 用排枪从A1和A2两个孔中吸取100ul加入到对应的B1和B2中,吹吸混合均匀,那么 B1和B2标准品浓度为500pg/ml。
6. 从B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中,混匀,那么C1和C2孔标准品浓度为250pg/ml。
7. 按照步骤4和5的方法倍比稀释到G1和G2两孔。G1和G2孔中标准品的浓度是15.6pg/ml,体积为225ul。
注意:4到6步骤稀释速度要快,避免时间过长,建议使用多通道排枪进行。
8. 设置H1和H2为空白对照(只加100ul稀释液),为了避免胡克效应的影响,我们建议可以采用A1和A12作为空白对照孔,而不设置样品或标准品。

 

实验材料:

1. 铝铂包预包被mouse IFN-抗体的ELISA板。
2. 100ul结合生物素的anti-mouse IFN-检测抗体。
3. 2瓶mouse IFN-标准品干粉,2ng/ml以上浓度重悬。
4. 10×ELISA包被缓冲液。
5. 1瓶12ml样品稀释液。
6. 1瓶检测浓缩液(20X)5ml(1XPBS+1%Tween20+10%BSA)。
7. 1瓶浓缩洗液(50ml,20X,1XPBS+1%Tween20)
8. 1瓶底物(15ml)
9. 1瓶终止液(15ml,1M 磷酸)
10. 封板膜
11. 蓝色、绿色和红色三瓶染料(各0.4ml)

仪器

1. 吸管和单通或多通移液器
2. 冰箱
3. 排枪水槽
4. 分光光度计
5. 洗板机

实验流程:
注意:孵育时间和洗涤次数请严格按照说明书执行,不得随意更改。
放大液要使用之前现配先用,不得预先配置,洗涤效果对结果至关重要。

1. 取出板子,安排样品,标准品排布顺序。
2. 用400ul1×洗液洗涤ELISA板子两次,每次10—15s(小心不得抓板孔表面,洗涤间歇不得过大,不能使板孔晾干)。
3. 按下图稀释标准品(在培养板中稀释)。

 

4. 加100ul样品稀释液至H1,H2孔中。
5. 加50ul 样品稀释液到样品孔中,加50ul样品到样品孔中。
6. 准备生物化抗体(检测抗体),所有孔中各加50ul,封板室温(18-25摄氏度)震荡(100rpm/min)孵育2h。
7. 准备抗生物素的HRP,弃掉板子中液体,并用洗液洗涤3次。
8. 向所有孔中个加100ul稀释好的HRP,封板室温(18-25摄氏度)震荡(100rpm/min)孵育1h。
9. 弃掉板子中液体,并用洗液洗涤3次,向所有孔中个加100ulTMB底物。封板室温(18-25摄氏度)孵育10-20min,每孔加100ul终止液。
10. 450nm读板。

结果计算:(需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量)。
1. 计算标准品,空白和样品孔平均OD值。
2. 样品OD值减去空白孔平均OD值。
3. 利用软件拟合出4参数的对数标准曲线,也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度,Y轴为平均OD值的各个点,然后大致拟合出相应的曲线。最佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。
4. 利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。
5. 如果在实验前样品经过稀释,则结果需要乘于稀释倍数。

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