ELISpot

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Human IFN ELISpot

Human IFN-γ ELISpot操作指导

A. 准备和预包被板的封闭(无菌操作)

1. 从密封的包装袋中拿出ELISpot板,用无菌PBS洗4次(200?l/孔)。

2. 用10%血清的完全培养基封闭(200?l/孔),室温孵育30分钟。

B. 细胞的孵育(无菌操作)

1. 倒掉培养基,加入细胞悬液并加入刺激因子,如抗原(终体积100-150?l/孔)。用mAb CD3-2 为阳性对照。

2. 把板子放到37℃ 5%CO2培养箱孵育12-48小时。在此过程中不要移动板子,并用铝箔纸包上板子以避免边缘效应。 C. 斑点的检测 1. 倒掉细胞,用PBS洗5次(200?l/孔)。 2. 用0.5%胎牛血清的PBS稀释检测抗体为1?g/ml,每孔加入100?l室温孵育2小时。

3. 洗板5次。

4. 用0.5%胎牛血清的PBS 1:1000稀释链霉亲和素,每孔加入100?l室温孵育1小时。

5. 洗板5次。

6. 通过0.45?m过滤器过滤底物(BCIP/NBT),每孔加入100?l,等待清晰的斑点形成。

7. 用自来水冲洗停止显色,冲洗板子的后面。

8. 晾干板子。在显微镜下或用ELISpot计数仪对斑点计数。

9. 室温避光储存板子。注意:如果是未包被的板子,在使用之前需要包被抗体,包被过程为:

1. 用无菌PH7.4 PBS稀释包被抗体浓度为15?g/ml。

2. 从密封的包装袋中拿出ELISpot板,每孔加入50?l 70%乙醇预湿。预湿时间不要超过2分钟。

3. 晃动板子尽快吹干,用无菌水洗5次,200?l/孔。

4. 每孔加入100?l抗体溶液,4℃过夜。

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