ELISPot操作流程：

1. ELISPOT包被

2. 每孔加 入20μl的70％乙醇预湿PVDF膜、甩干。用无菌PBS洗涤，每孔加入100μl， 洗涤2次去除乙醇。用灭菌PBS稀释包被抗体，每孔加 入100μl已稀释好的包被抗体(终浓度10μg/ml)到各实验孔。4°C包被过夜或室温包被2小时。

2. 封闭

倾倒包被液，用无 菌PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。每孔加入200μl细胞培养液封闭，室温孵育1小时。

3. 细胞培养

倾倒封闭液，须洗涤，直接加入准备好的细胞。（初次进行试验，应作刺激物浓度梯度、和∕或细胞计数梯度预实验）实验组孔加入细胞和刺激物，阳性对照组每孔 加入10μl PHA（PHA终浓度1-4ug/mL），阴性对照组每孔只加细胞。37°C二氧化碳培养箱中培养16-24h。

4. 检测

用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。 甩干, 用抗体稀释液（PBS＋1％BSA）稀释检测抗体。每孔加入1：1000稀释好的生物素记检测抗体100μl，室温孵育2h。用 PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。 甩干, 用抗体稀释液（PBS＋1％BSA）稀释酶亲和素 ，每孔加入1：1000稀释好的酶亲和素 ，室温孵育1h。

5. 显色

用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次，PBS洗板1次。拍干。加 入50μl BCIP·NBT显色液。室温静置15-45min，注意避光。

6. 终止显色自来水冲洗板子，室温干燥后在倒置显微镜下观察结果或使用自动酶联斑点图像分析仪进行分析。