中和实验

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抗体中和IFN-γ抗病毒作用

1、材料
L-929 细胞系(ATCC Cat# CCL-1)或A549 人类肺癌细胞(ATCC Cat# CCL-185)
培养基:RPMI1640+10%FBS。
检测培养基:RPMI1640+2%FBS。
96孔板(平底)(Costar Cat.No.3595)
EMC病毒(脑心肌炎病毒),107pfu/ml 等分-80度冻存(避光)。
MTT溶液:(Sigma Cat. No. M5655)5mg/ml 储液(PBS稀释),室温避光保存。
MTT裂解液:20%SDS或50%DMF。

2、仪器
吸管和移液器
恒湿培养箱
96孔微孔检测分光光度计

3、持续时间
孵育时间24小时
测定样品准备时间1小时

4、实验步骤
(1) 使用检测培养基制备L929或A459悬液,调整细胞浓度为3.5×105/ml,每孔加100ul细胞悬液。37度 5%CO2 恒湿培养箱培养过夜。
(2) 另一块稀释板中每孔加50ul检测培养基。
(3) 使用两倍的连续稀释液从第3排到第12排依次稀释功能级别的抗细胞因子抗体(见速查表标准范围),留1,2排不加。
(4) 2排到12排每孔加50ul重组细胞因子和样品(浓度见速查表,第二排是细胞因子和指示细胞组),1排是只有细胞的对照组。
(5) 37度 5%CO2 恒湿培养箱培养2小时。
(6) 将50ul的抗原抗体混合液加到包含细胞的对应孔中。
(7) 孵育6小时。
(8) 小心弃上清,加100ul EMC病毒液调整密度为1-4×104pfu/ml(人类IFN-γ 1:20稀释病毒储液;而小鼠IFN-γ 1:1000稀释病毒储液)
(9) 37度 5%CO2 恒湿培养箱培养40小时。
(10)每孔加10ul MTT溶液(5mg/ml),孵育4小时。
(11)每孔加50ul MTT 裂解液,孵育过夜。
(12)570-650nm 读板。
(13)绘制标准曲线分析数据。

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