Flow Cytometry

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流式表面抗原染色方法

方案A:细胞悬液的表面抗原染色。
方案B:一步法胞内蛋白染色(细胞核)。

小贴士:
1、流式抗体要储存于避光4度,严格避免冻融。
2、流式抗体使用前要离心3min,避免贴壁盖的损失,请勿斡旋混匀。
3、避免细胞成团,以免堵塞流式细胞仪。
4、eFluor纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。


方案A: 细胞悬液的表面抗原染色

实验材料:

15×75mm圆底流式管或96孔板
直标一抗或纯化抗体
二抗(可选)
抗小鼠CD32/16抗体(eBioscience Cat. No. 14-0161)
人FCR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)
流式染色液(eBioscience Cat. No. 00-4222)可自行配制
eFluor纳米晶体抗体染色液(eBioscience Cat. No. 00-3222;可选)
7-AAD活度染色液(eBioscience Cat. No. 00-6993)或PI染色液(eBioscience Cat. No. 00-6990)

实验流程:
1、按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞,调整浓度为2×107/ml。
2、(可选)封闭FCR介导的非特异性反应:
小鼠:染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗体,孵育20min。
人类:染色之前加20ul 人FCR结合抑制剂孵育20min。
3、等分细胞悬液,每管50ul,再补加50ul染色液。
4、按照抗体说明书加入适量抗体,轻弹混匀。
5、直标抗体。


方案B:淋巴组织细胞制备

实验材料:

60×15mm 的组织培养皿
[5ml 注射器
细胞过滤器(尼龙网过滤)
eBioscience® 流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的离心管。

注意:
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀释为工作液(1:4稀释)。

实验方案:
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次,离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液,斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min(小鼠样品最长可以四度固定18小时)。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
7、300g 室温离心5min,弃上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后,加入二抗FOXP3 (或其他胞内抗原抗体),室温避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次,300g 室温离心5min,弃上清。
10、加2ml 流式染色液,300g 室温离心5min,弃上清。
11、适量流式染色液重悬,即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。

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