Human IFN-γ/IL-2 Fluorospot操作指导这个过程是利用两种荧光染色检测IFN-γ和IL-2，这个过程也可以调整为单染，可以用1-D1K或者IL2-I/249包被抗体包被。

A 准备板子并双荧光包被（无菌操作）

1． 用无菌PH7.4 PBS稀释1-D1K和IL2-I/249包被抗体，终浓度为15?g/ml。

2． 从密封的包装袋中拿出Fluorospot IPFL板，每孔加入15?l 35%乙醇预湿，此预湿过程不要超过1分钟。

3． 无菌水洗板5次，200?l/孔。

4． 每孔加入100?l抗体溶液，4℃过夜。

B 细胞的孵育（无菌操作）

1. 倒掉板子液体，无菌PBS洗5次（200?l/孔）。

2. 用10%血清的PBS封闭（200?l/孔），室温孵育30分钟。

3. 倒掉培养基，加入细胞悬液包括anti-CD28(0.5?g/ml)和刺激抗原，终体积100-150?l/孔。

4. 把板子放到37℃ 5%CO2培养箱过夜孵育。在此过程中不要移动板子，并用铝箔纸包上板子以避免边缘效应。

C 斑点的检测

1． 倒掉细胞，用PBS洗5次（200?l/孔）。

2． 用0.1%胎牛血清的PBS 1:200稀释检测抗体7-B6-1-FS-FITC和稀释IL2-I生物素为2?g/ml，每孔加入100?l室温孵育2小时。

3． PBS洗5次（200?l/孔）。

4． 用0.1%胎牛血清的PBS 1:100 稀释anti-FITC Green 和1:200稀释SA-Red，每孔加入100?l室温孵育1小时。

5． PBS洗5次（200?l/孔）。

6． 倒掉板中液体，每孔加入100?l荧光强化剂，室温孵育15分钟。

7． 轻敲板子倒掉荧光强化剂。拿掉板子下面的塑料品，用自来水轻轻冲洗板子的后面。

8． 避光吹干板子。避光保存。