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刺激活化小鼠外周T细胞方案

日期:2012年3月2日 浏览次数:2,747

1. 材料

1×PBS无菌
Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, Cat. No. 16-0031, or Purified, Cat. No. 14-0031)
Anti-mouse CD28, Clone 37.51 (Functional Grade, Cat. No. 16-0281)
RPMI1640完全培养基:
900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. SH30027.02)
100 mL FBS (Hyclone Cat. No. SH30151.03) Heat inactivated (10% final)
1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. No. 21985-023)
10 mL L-Glutamine (Hyclone Cat. No. SH30034.01)
Antibiotic cocktail (可选)
小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液(无菌)
带盖的无菌96孔培养板(Costar Cat. No. 3596)
刀豆蛋白A(ConA, Sigma Cat. No. C5275)

2. 仪器:

吸管和移液器
37度CO2培养箱
台式低温离心机

3. 实验持续时间

包被抗体时间:2-18小时
制备脾脏单细胞悬液时间:20分钟
处理细胞培养时间:20分钟
培养时间:2-4天

4. 实验方案

1)抗体预包被:
(1) 用无菌PBS配制5-10ug/ml 的CD3e抗体溶液,根据实验设计和复孔的数目计算所需抗体工作液的量。例如包被48孔,则需要抗体体积为2.6ml。
2) 每孔加CD3e抗体溶液50ul,空白孔加PBS。
(3) 盖板,四度孵育过夜或37度孵育2小时。
(4) 除去抗体溶液,无菌PBS洗涤2次,即可加细胞悬液。

2)添加细胞:
(1) 取小鼠脾脏制备单细胞悬液,按照方案除去红细胞。
(2) 完全培养基定容细胞为106/ml(该密度是TCR介导T细胞活化实验的最佳浓度;亦可依据自己实验经验摸索最佳浓度)。
(3) 每孔加200ul细胞悬液(可加1-4ug/ml,ConA刺激)。
(4) 加入可溶性的CD28抗体,2ug/ml。
(5) 37°C, 5% CO2培养箱培养2-4天,具体增殖的最佳时间依赖实验者摸索。
(6) 收获细胞,继续其他方面的实验。

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