细胞毒实验是一种在体内、外研究具有杀伤靶细胞功能的免疫效应细胞与分子的实验技术。随着免疫学技术的发展，近年来对具有杀伤功能的免疫效应细胞与分子的报道有很多。在免疫效应细胞与分子中，既有非特异性杀伤细胞和特异性杀伤细胞，同时又有非特异性细胞毒因子和特异性细胞毒因子，他们的免疫反应最终会导致靶细胞裂解死亡。细胞毒作用检测研究应用大致可以分为以下几类：

(1) 非特异性杀伤肿瘤细胞：如自然杀伤细胞（NK细胞）、K细胞，在肿瘤细胞的杀伤中扮演重要的角色。

(2) 特异性杀伤肿瘤细胞：如：TC或者TK杀伤细胞，该细胞的特异杀伤需要抗原预先致敏TC或TK细胞。

(3) 中药对杀伤细胞的调节作用：中药的现代研究证明许多补气类药物可以促进细胞产生干扰素（IFN-γ，α，β）、IL-2等细胞因子，增强NK，TC细胞的杀伤效应。

(4) 单克隆抗体的生物导弹作用：将杀伤肿瘤的毒性药物与肿瘤细胞抗原单克隆抗体结合，就会特异性杀伤肿瘤细胞。

(5) 药物的毒性作用：为了筛选细胞毒物质和抑制物质（如化疗药物），通过体外实验寻找最佳化疗药物和最佳用药浓度，从而为临床提供参考。

检测这些免疫效应细胞和分子细胞毒活性的方法有很多，大都是体外细胞毒实验，且都有一定的局限性和缺点，如51Cr释放实验是标准的细胞毒活性测定法，虽然得到广泛应用，但51Cr半衰期短且国内没有生产。MTT法难以客观反映细胞毒活性。近年来，随着流式细胞术的不断发展和普及，建立了以荧光素标记靶细胞并结合细胞毒相关酶染料检测细胞毒活性的流式细胞术体内和体外分析方法。

相关产品：
CyToxiLux® , GranToxiLux®, 和PanToxiLux™基于单细胞水平荧光探针细胞毒测定试剂盒。

1．检测原则：

通过流式细胞仪或荧光显微镜测定导致细胞死亡细胞毒性淋巴细胞致死性打击的传导和相关蛋白酶活性，反映和探讨细胞杀伤作用及机制。

CyToxiLux® : 测定caspase下游信号

GranToxiLux®: 颗粒蛋白酶B

PanToxiLux™: 颗粒蛋白酶B 和caspase 上游信号

CyToxiLux® , GranToxiLux®, 和PanToxiLux™三种方法测定细胞毒作用不管从检测时间还是敏感度都优于LDH（乳酸脱氢酶）、⁵¹Cr和PI等方法。

检测原理：端粒酶B存在于CTL和NK等效应细胞的溶酶体颗粒内，通常没有活性。当靶细胞诱导效应细胞脱颗粒时，颗粒酶B和其他颗粒物质如穿孔素等就随后释放出来作用于靶细胞。因此检测靶细胞内颗粒酶B的活性可以对细胞介导的杀伤作用进行定量评价。

2. 技术优点：

1) 细胞毒测定基于导致细胞死亡的基本生物化学反应，而不是仅仅针对细胞膜缺失及其他结局。

2) 与其他检测方法相比灵敏度高。

3) 节约检测时间,效应细胞和靶细胞共孵育的时间约为0.3～2h。

4) 可以采用流式细胞仪和免疫组化的方法对靶细胞进行测定。

5) 结合流式细胞仪的多参数检测分析，不仅可以对CTL细胞毒作用进行分析还可以对效应细胞的生理和生化进行分析，增加了结果分析的广度。

注：不宜使用荧光标记的探针标记细胞，因为探针会影响效应细胞和靶细胞共孵育时的相互作用。

3. 检测步骤：

实验前准备：

配置TLF4：加25μl TFL稀释液至Vial TFL4 中，混匀溶解，-20℃冻存。

Medium T配置：标记靶细胞用，1×PBS+ 配置好的TFL4（若培养基中含有10%FBS，则浓度为1000：1；若无，则3000：1；可根据预实验结果调整浓度）。

洗液：按标明用量离心洗涤细胞，小心去上清，轻弹重悬细胞，注意勿斡旋混匀。

1) 靶细胞准备：

将靶细胞用Medium T重悬成2*10⁶cells/ml（建议小于该浓度使用，确保流式分析可以收集到5000~10000个靶细胞即可），37℃孵育15min（孵育时间长短可依照预实验结果进行调整）；用10倍体积的PBS洗涤2次，300g 离心弃上清，用wash buffer 重悬标记后的靶细胞，1*10⁵cells/孔（依照实验设计调整细胞数目）分配细胞。

2) 效应细胞的准备：

将效应细胞PBS洗涤一次计数，用wash buffer 调整效应细胞最佳浓度（依照实验设计调整），若E:T Ratio为20：1，则每孔加入2*10⁶cells

3) 孵育靶细胞和效应细胞：

加100ul 效应细胞悬液至靶细胞管，留两个靶细胞空白管，再加两个不含靶细胞只含有效应细胞的管，对照组补足wash buffer 终体积为200ul/tube；300g离心5min，小心弃上清，加入Vial GS底物（对照组加PBS），加入ADCC抗体，迅速离心30s，孵育0.5～2h（建议预实验调整孵育时间，一般单时间点孵育1h，不宜孵育过长）。

样品设置：

A：靶细胞（TFL-4标记后）

B: 靶细胞+GS底物

C：效应细胞

D：效应细胞+ GS底物

E：效应细胞+靶细胞+ GS底物

4) 用200µl wash buffer洗涤每个样品，100µl重悬时用移液枪混匀；

5) 流式细胞仪检测分析（TFL-4-APC；CG-FITC）,步骤如下：

A. 上A和D样品设定流式细胞仪APC，FITC通道电压：上A样品将APC阳性细胞群调至10³ ，上D样将FITC阳性细胞群调至10¹ ；则B样品细胞APC处于 10³，FITC荧光处于10¹ （注：正常健康细胞TFL-4标记靶细胞应该是单个细胞群，如果不是单个细胞群则降低TFL-4的标记时间或者降低TFL-4浓度）。

B. 上其余样品管，收集5000～10000个细胞分析结果。

4. 产品组成：

*产品信息