无信号/荧光强度弱

不正确的信号补偿

检查流式细胞仪阳性单一颜色对照是否正确，通道和补偿设置是否能正确的捕获所有粒子。

没有足够的抗体来检测

增加抗体的量/浓度

无法接近细胞内目标

检查目标蛋白是否在细胞内。对于胞内染色，确保有足够的通透性。为防止细胞表面蛋白质的内化，该过程应用冰冷的试剂，在冰上或4℃进行，以终止一切反应。加入叠氮化钠可防止表面抗原的修饰和内化带来的荧光强度的损失。对于细胞系染色，胰蛋白酶可以引起细胞表面蛋白质的内化，尤其是细胞表面分子，可能需要更温和的分离方法。

细胞内染色结合荧光分子太大

对细胞内染色实验，荧光分子应具有较小的分子量。大分子量荧光染料会降低抗体的动力和进入细胞的可能性。

激光器未对齐

确保流式细胞仪的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微球来调整路线。如果激光器不能正确对准或发生漂移时，您可能需要考虑联系此机的客服。

目标蛋白不存在或处于低水平表达

确保组织或细胞类型表达的目标蛋白处于一个足够检测的量。

可溶性或分泌型目标蛋白

目标蛋白是否可溶并从细胞内分泌？需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里以便流式细胞仪能很容易检测到。通过高尔基体封闭的步骤，比如加入Brefeldin A，可提高细胞内染色信号。

补偿过高或增益过低

使用阳性对照再次设置流式细胞仪，利用补偿以确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理的范围内）。

荧光分子的荧光逐渐消退

抗体可能放置时间太长或没有避光。

一抗和二抗不匹配

二抗应该是和一抗来源物种相同（例如一抗来源于兔，就要使用抗兔的二抗）。

荧光强度过高

抗体浓度过高

这将导致较高的非特异性结合或非常高的荧光强度，减少每个样本中加入的抗体量。

过量抗体被困

这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton。

封闭不足

与封闭步骤一样，抗体中加入1-3%封闭试剂。

背景高或阳性细胞百分比高

增益设置过高或补偿过低

使用阳性对照再次设置流式细胞仪，用补偿减少颗粒背景并减少增益以降低信号。

抗体过量

降低抗体浓度。您还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，以确保洗去多余的抗体。