ELISA 操作中容易出现哪些问题?

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  • 避免CV值较高的方法
  • 1、从-20℃拿出后马上使用板子,不要把板放到箔外面太长时间,否则板子会吸收水分;
    2、等到沉淀物彻底溶解再加样品;
    3、不要上下吸液稀释沉淀物;
    4、在洗涤的过程中至少加入400µl 洗涤液,加入后洗涤液应该在孔内存留几秒;
    5、小心的拿掉标准品上的覆盖物。

  • ELISA OD值较低的原因
  • 1、用TMB底物孵育的时间太短了;
    2、冻干标准品的定容体积不正确;
    3、定容时间太短;
    4、浓缩储存液稀释不正确;
    5、孵育过程不震荡可能会降低OD值。

  • ELISA标准曲线不正确的原因
  • 1、低压冻干的标准品定容的体积不正确;
    2、定容的时间太短,标准品还没有完全溶解;
    3、浓缩标准品的稀释不正确;
    4、稀释材料的储藏不正确;
    5、标准品被污染;
    6、稀释标准品时没有混匀;
    7、测量波长没有使用正确。

  • 显色后颜色没有变化的可能原因
  • 1、试验开始前没有把试剂放到室温;
    2、 ELISA试剂的储存条件不正确;
    3、HRP-结合物被污染;
    4、HRP-结合物稀释不正确;
    5、遗漏掉一步孵育;
    6、微孔板在洗涤或储存的过程中脱水;
    7、在洗涤或移液的过程中包覆物被破坏;
    8、样品不适合本实验。

  • 高背景的原因
  • 1、洗涤不正确:
    遗漏一步洗涤可能导致高背景。加入适当体积的洗涤液确保洗涤次数正确,确信正确的稀释洗涤液并且在孔内存留几秒。
    2、底物被污染:
    在使用之前确保底物没有金属离子污染和被氧化,底物本身是不带颜色的。
    3、稀释剂污染:
    大多数ELISA的稀释剂都是蛋白质基质,一开始可能污染稀释剂,应该用灭菌的移液管移出稀释剂。
    4、底物暴漏于光下:
    直接暴露于灯下,会使底物颜色表问深蓝色。
    5、偶联物稀释不正确:
    确保每一步都按照稀释指导手册进行,偶联物浓度太高可能会导致高背景。
    6、孵育时间/温度不正确:
    孵育时间/温度严格按照ELISA操作说明进行
    7、ELISA板储存错误:
    只用了一部分板,要确保剩余的一部分4℃ 储存。