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敲除保守顺式调控元件 CRE 上调髓系细胞 Hdac9，加重动脉粥样硬化病变

构建 CRE 片段敲除小鼠（Hdac9ΔCRE），与Apoe-/-小鼠杂交。无论普通饲料还是致动脉粥样硬化高脂饲料，Hdac9ΔCRE Apoe-/-小鼠主动脉斑块面积显著增大，斑块内巨噬细胞浸润增多；CRE 仅在动脉粥样硬化主动脉、髓系细胞上调 Hdac9，不改变邻近基因 Twist1 及其他 HDAC 家族基因表达。（参考图 1）

本研究使用 Luminex ProcartaPlex 多重细胞因子检测平台，使用Th1/Th2 Cytokine & Chemokine 20-Plex Mouse Panel 1（货号：EPX200-26090-901）对小鼠 EDTA 血浆开展 20 种细胞因子、趋化因子同步定量。Luminex 凭借微量样本、高通量并行检测优势，一次性对比野生型与Hdac9ΔCRE小鼠全身炎症介质水平；结果显示 CRE 敲除小鼠循环 IL‑1β、IL‑6、IL‑18 水平显著升高，在体液层面证明 CRE‑HDAC9 轴调控体内炎症小体依赖的炎症应答。（参考图 1H‑1J）

图1. 靶向删除Hdac9基因位点的CRE序列可加剧动脉粥样硬化进程 (A)：与人类动脉粥样硬化表型相关的HDAC9基因风险变异位点位于顺式调控元件（CRE）区域，该区域在不同物种中具有保守性且富含活性组蛋白修饰标记。图中展示了来自各GWAS研究中、与冠状动脉疾病（CAD）、大动脉卒中（LAS）、外周动脉疾病（PAD）及动脉粥样硬化性主动脉钙化（AACs）相关的先导信号rs2107595上下游±5 kb范围内的所有常见变异位点。Hdac9DCRE小鼠缺失了1.1 kb的CRE序列；另见图S1A和图S1B。（B–E）Hdac9DCREApoe/与对照组Hdac9+/+Apoe/小鼠接受普通饲料喂养28周。(B)代表性油红O染色显示的主动脉根部斑块（箭头标示）；(C)主动脉根部斑块面积定量分析；每组n=7只小鼠，采用双尾非配对t检验；(D)代表性Mac2免疫组化染色结果；(E)巨噬细胞面积定量分析；每组n=7只小鼠，采用双尾非配对t检验。比例尺：(B)与(D)中为200 μm；另见图S1C–S1K。（F和G）Hdac9DCREApoe/与对照组Hdac9+/+Apoe/小鼠接受普通饲料喂养14周。对Hdac9基因(F)在不同组织中的表达水平进行分析，并以Hprt1为内参进行标准化校正；每组n=4–9只小鼠，采用双因素方差分析结合Sidak多重比较检验；(G)测定Hdac9DCREApoe/与对照组Hdac9+/+Apoe/小鼠动脉粥样硬化主动脉中促炎性细胞因子的mRNA表达水平；每组n=6只小鼠。另见图 S2A–S2K。（H–J）Hdac9DCREApoe 小鼠与对照组 Hdac9+/+Apoe 小鼠均接受为期 28 周的普通饲料喂养。采用 Luminex 多重细胞因子检测平台测定血浆中细胞因子及趋化因子水平；每组基因型小鼠 n = 6–10 只。对 Il-1b 与 Il-18 采用双尾 Mann-Whitney 检验，对 Il-6 采用双尾非配对 t 检验；另见图 S2L–S2T。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。

髓系细胞是 HDAC9 促动脉粥样硬化效应的关键细胞类型

分选多种血管相关细胞，CRE 缺失只上调髓系细胞、骨髓来源巨噬细胞 BMDM 的Hdac9表达，T 细胞、平滑肌细胞、内皮细胞表达不受影响。骨髓移植实验：向辐照Apoe-/-小鼠回输Hdac9ΔCRE来源骨髓，小鼠斑块增大、坏死核心扩张、胶原减少、斑块易损指数升高；反之髓系特异性敲除 Hdac9ΔCRE可显著缩小斑块、改善斑块稳定性。（参考图 2）

图2. CRE基因缺失可上调髓系细胞中Hdac9的表达，从而加剧动脉粥样硬化（A–C）。对从Hdac9DCREApoe⁻/⁻及对照Hdac9⁺/⁺Apoe⁻/⁻小鼠的脾脏（髓系细胞）与骨髓（BMDMs）中分离的动脉粥样硬化相关细胞类型进行Hdac9表达分析。(A)实验方案。CD11b⁺髓系细胞(B)及BMDMs(C)中Hdac9的基因表达情况；T细胞、内皮细胞（ECs）及平滑肌细胞（SMCs）见图S3。采用Hprt1作为内参基因。每组n = 4–11只小鼠。采用双尾非配对t检验。另见图S3A–S3G。（D–I）经致死剂量辐照的Apoe⁻/⁻小鼠分别接受来自Hdac9DCREApoe⁻/⁻（Hdac9DCRE）或Hdac9⁺/⁺Apoe⁻/⁻（Hdac9⁺/⁺）小鼠的骨髓移植，并饲喂西方饮食12周以诱导晚期动脉粥样硬化。(D)实验方案。(E)代表性油红O染色的主动脉根部斑块（箭头标示）。(F)主动脉根部斑块面积定量分析。每组n = 12只小鼠。采用双尾非配对t检验。(G)坏死核心面积定量分析。(H)胶原含量定量分析。(I)整体病变易损性评估。每组n = 8–11只小鼠。采用双尾非配对t检验。另见图S3H–S3R。（J–N）在Apoe⁻/⁻遗传背景上，分别对髓系特异性Hdac9缺陷型（Hdac9LysM）及对照型（Hdac9fl/fl）小鼠饲喂西方饮食12周。(J)代表性油红O染色的主动脉根部斑块（箭头标示）。比例尺：200 μm。(K)主动脉根部斑块面积定量分析。每组n = 10–12只小鼠。双尾非配对t检验；对晚期斑块进行进一步分析；坏死核心面积(L)与胶原含量(M)的定量测定；每组基因型对应5–6只小鼠；(L)采用双尾非配对t检验，(M)采用Mann–Whitney U检验；(N)易损斑块指数；每组基因型对应5–6只小鼠；采用双尾非配对t检验；另见图S4A–S4G。数据以均值±标准误表示。

CRE‑HDAC9 通路驱动 NLRP3 炎症小体活化与巨噬细胞焦亡

分离 BMDM 进行 LPS + 尼日利亚素刺激；Hdac9ΔCRE巨噬细胞 caspase‑1 活性升高，剪切活化 caspase‑1、GSDMD 增多，IL‑1β 释放上升，巨噬细胞焦亡增强；Hdac9ΔCRE基因敲除或使用 IIa 类 HDAC 抑制剂 TMP195 处理，则抑制 caspase‑1、GSDMD 活化，降低焦亡。体内实验证实髓系敲除Hdac9ΔCRE降低主动脉斑块 caspase‑1 剪切产物与循环 IL‑1β。使用 NLRP3 特异性抑制剂 MCC950 处理Hdac9ΔCRE小鼠，可以逆转 CRE 敲除带来的动脉粥样硬化加重表型，证明 HDAC9 致粥样硬化效应高度依赖 NLRP3 炎症小体。（参考图 3）

图3. CRE调控Hdac9表达以促进炎症小体激活（A–C）：将Hdac9DCREApoe/(Hdac9DCRE)与对照组Hdac9+/+Apoe/（Hdac9+/+）的BMDMs分别用LPS（300 ng/mL）刺激3小时及用尼格里辛（5 mM）刺激45分钟。(A)采用生物发光Caspase-Glo 1炎症小体检测试剂盒对caspase-1活性进行定量分析。 RLU 表示相对荧光素酶单位。每组n=5只小鼠。采用双尾非配对t检验。(B)代表性免疫印迹图显示caspase-1的裂解情况。每张膜图左侧标注为分子量标记（单位：kDa）。(C)裂解型caspase-1经β-肌动蛋白标准化后的定量分析。n=5次独立实验。采用双尾非配对t检验。另见图S5A–S5H。（D–J）Hdac9的遗传学与药理学抑制实验：将Hdac9/Apoe/（Hdac9/）、对照组Hdac9+/+Apoe/（Hdac9+/+）及TMP195处理的Apoe/BMDMs（TMP195）分别用LPS（100 ng/mL）刺激3小时及用尼格里辛（5 mM）刺激60分钟。(D)代表性免疫印迹图显示caspase-1的裂解情况。(E)裂解型caspase-1经β-肌动蛋白标准化后的定量分析。n=5次独立实验。采用双尾非配对t检验。(F)IL-1β释放量的定量分析。n=5次独立实验。采用双尾非配对t检验。(G)裂解型 GSDMD 的代表性免疫印迹图。(H)裂解型 GSDMD 经β-肌动蛋白标准化后的定量分析。n=4次独立实验。采用双尾非配对t检验。(I)Zombie NIR +细胞的定量分析。n=4次独立实验。图中显示为每视野Zombie NIR +细胞数（3×3×4个视野）。双尾非配对t检验。另见图S5I。(J)LDH释放量的定量分析。完全裂解后的最大LDH活性作为对照。n = 10次独立实验。(K)ASC寡聚化的代表性免疫印迹结果。代表两次独立重复实验。另见图S5J。（L和M）髓系特异性Hdac9缺陷型（Hdac9LysM）与对照型（Hdac9 fl/fl）小鼠（均基于Apoe基因型背景）接受Western型饮食喂养12周后，分离并裂解其动脉粥样硬化主动脉用于Western blotting分析。(L)裂解型caspase-1相对于actin及Cd68的定量分析。每组n = 3只小鼠。双尾非配对t检验。另见图S5K与S5L。(M)循环Il-1b水平的定量分析（经ROUT异常值检测法剔除离群值，Q = 1%）。Mann-Whitney检验。

HDAC9 直接结合 NLRP3 的 NACHT/LRR 结构域，通过去乙酰化促进 NLRP3 寡聚组装

免疫共沉淀、质谱、微量热泳动 MST 证实 HDAC9 与 NLRP3 发生直接蛋白相互作用，不结合 AIM2、NLRC4；互作主要发生在 NLRP3 的 NACHT、LRR 结构域，PYD 结构域不参与结合。HDAC9 介导 NLRP3 NACHT‑LRR 结构域去乙酰化，促进 NLRP3 寡聚化，该过程可不依赖 NF‑κB 介导的转录预激步骤。（参考图 4）

图 4. HDAC9 结合并介导 NLRP3 的去乙酰化以激活炎症小体(A)将 HEK293 细胞与 V5-HDAC9 或 V5 空载体以及 FLAG 标记的全长 NLRP3、NLRC4 或 AIM2 进行瞬时共转染。图中所示为代表性免疫印迹结果，展示了 HDAC9 与 NLRP3（而非 NLRC4 和 AIM2）的结合情况。n = 4 次独立实验。另见图 S5O–S5Q。(B)将 HEK293 细胞与 V5-HDAC9 和 FLAG 标记的全长 NLRP3 进行瞬时共转染。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定 NLRP3 的相互作用蛋白。n = 4 次独立实验。（C 和 D）代表性免疫印迹结果，展示 HDAC9 与 NLRP3 特定结构域（均经 FLAG 标记）的结合情况。n = 3–4 次独立实验。图(C)下方为 NLRP3 结构域的示意图。(E)用 LPS（200 ng/mL）刺激 THP1 巨噬细胞 6 小时，随后用 5 mM 尼日利亚菌素刺激 60 分钟。采用抗 NLRP3 抗体对内源性 NLRP3（下图）进行免疫沉淀，并采用抗 HDAC9 抗体检测内源性 HDAC9（上图）。图中所示为代表性免疫印迹结果，展示在内源性水平下 HDAC9 与 NLRP3 的结合情况。n = 3 次独立实验。图中标出了 HDAC9 与 NLRP3 的条带以及 IgGH 和 IgGL（作为免疫沉淀 [IP] 侧产物）的条带。(F)采用 MST 法在溶液中分析 HDAC9 与 NLRP3 之间的蛋白质-蛋白质相互作用。将 15 nM MST-red-NLRP3 与浓度递增的 HDAC9 进行滴定。图中展示了在不同HDAC9浓度（对数坐标）下，结合态MST-red-NLRP3所占比例（结合比例）的变化情况。数据表示为均值 ± 标准差，每个HDAC9浓度对应4个实验数据点；两次独立滴定实验均在两组独立的毛细血管样本中进行。（G–K）将V5-HDAC9与FLAG标签标记的全长或突变型NLRP3共转染至HEK293细胞中。(G)NLRP3乙酰化水平的代表性免疫印迹结果。(H)经β-肌动蛋白标准化后的乙酰化NLRP3定量分析。n = 10次独立实验；采用双尾非配对t检验。(I)经β-肌动蛋白标准化后的乙酰化NLRP3- DPYD 定量分析；代表性免疫印迹结果见图S5R。n = 5次独立实验；采用双尾非配对t检验。另见图S5R。(J)代表性免疫印迹图，显示经尼日利亚菌素刺激的转染HEK293细胞中NLRP3寡聚化情况，通过蓝绿温和PAGE进行分析。(K)经β-肌动蛋白标准化后的NLRP3寡聚体定量分析。n = 7次独立实验；采用双尾非配对t检验。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。

脂蛋白纳米生物制剂靶向髓系细胞递送 TMP195，稳定已形成的动脉粥样硬化斑块

构建负载 TMP195 的脂蛋白纳米颗粒 TMP195‑NB，对已经形成斑块的Apoe-/-小鼠静脉给药；纳米制剂可以靶向髓系炎症细胞，在不改变外周免疫细胞计数前提下，显著缩小斑块坏死核心面积、提升斑块胶原含量，降低斑块易损指数。（参考图 5A‑5D）

人颈动脉临床样本验证 HDAC9 表达与斑块不稳定表型相关

纳入 615 例颈动脉内膜剥脱术患者的斑块样本；校正年龄、性别、血管危险因素后，斑块 HDAC9 高表达与大脂质核心、平滑肌细胞含量降低相关；有症状（发生脑血管事件）患者斑块 HDAC9 表达显著高于无症状患者。体外分离人源单核细胞，TMP195 处理能够抑制 caspase‑1 剪切、下调 IL‑1β、IL‑18 释放，证明该机制在人源细胞中保守。（参考图 5E‑5L）

图5. HDAC9靶向免疫疗法可稳定动脉粥样硬化斑块（A–D）。接受西方饮食喂养8周的Apoe⁻/⁻小鼠从第5周（此时斑块已形成）起，每周两次接受TMP195-NB（10 mg/kg）或安慰剂治疗。(A)实验方案。(B)代表性Masson三色染色结果；虚线及星号标示坏死核心区。(C)坏死核心区面积定量分析；每组n = 9–11只小鼠；采用双尾非配对t检验。(D)易损斑块指数；每组n = 9–11只小鼠；采用双尾非配对t检验。另见图S7A–S7L。（E–H）对因治疗有症状或无症状颈动脉狭窄而接受颈动脉内膜切除术患者的颈动脉粥样硬化斑块标本进行分析。(E)实验方案。(F)通过经年龄、性别及血管危险因素校正后的逻辑回归分析，探讨斑块HDAC9表达水平（每增加1个标准差）与大型脂质核心（二元性状）之间的关联；图中显示比值比（OR）及95%置信区间。N = 615例（经年龄和性别校正）及N = 530例（经年龄、性别及血管危险因素校正）。另见图S8A–S8C。(G)根据易损斑块指数评分对研究受试者斑块HDAC9表达水平（经逆秩转换）进行分析（p值来自Kruskal-Wallis检验）。图中显示了中位数（中心线）、上四分位数与下四分位数（箱线范围）以及1.53倍四分位距（须线）。由于绘图原因，12个HDAC9表达水平>100的离群观测值未予显示。统计学分析基于原始数据；无离群值的关联性显示p值=0.023。(H)有症状与无症状斑块患者中HDAC9斑块表达量（经逆秩转换处理）（p值通过Mann-Whitney U检验得出）。（I–L）从晚期动脉粥样硬化患者（n=6）中新鲜分离单核细胞，分别经TMP195或溶媒体外处理1小时，随后用LPS（100 ng/mL）刺激3小时及用尼日利亚霉素（5 mM）刺激60分钟。(I)Caspase-1裂解的代表性免疫印迹结果。(J)经β-肌动蛋白标准化后的Caspase-1裂解产物定量分析。n=6次独立实验。采用双侧非配对t检验。IL-1β(K)与IL-18(L)释放量的定量分析。n=6次独立实验。采用双侧非配对t检验。另见图S8D与S8E。数据表示为均值±标准误。

✅核心机制创新

该研究解析GWAS非编码风险位点的致病通路：HDAC9基因座顺式调控元件 CRE 的功能缺失，会特异性上调髓系细胞HDAC9；HDAC9直接结合NLRP3的NACHT‑LRR结构域，介导NLRP3 去乙酰化，促进 NLRP3 炎症小体组装活化，驱动 caspase‑1/GSDMD 依赖的巨噬细胞焦亡，大量释放 IL‑1β、IL‑18，最终加剧血管慢性炎症、斑块坏死核心扩张以及斑块不稳定。HDAC9 调控炎症小体活化可以独立于 NF‑κB 转录预激过程。

✅Luminex 技术核心支撑价值

Luminex技术为本研究关键的高通量体液检测工具：

①仅需要少量小鼠血浆样本即可同步检测二十余种炎症介质，横向对比不同基因型小鼠全身炎症谱，在体内体液层面佐证 HDAC9‑NLRP3 轴促进促炎因子释放；

②辅助验证 NLRP3 抑制剂、HDAC9 抑制剂干预后循环细胞因子的变化，为通路因果关系提供定量证据；

③该检测手段可扩展到临床大样本队列，为动脉粥样硬化患者炎症分层提供技术方案，规避多次 ELISA 带来的样本损耗与批次误差。

✅动物模型关键结论

1）CRE 是髓系细胞特异性的 Hdac9 表达调控开关，髓系细胞 HDAC9 升高就足以驱动动脉粥样硬化进展；

2）HDAC9 促粥样硬化效应几乎完全依赖 NLRP3 炎症小体；

3）利用脂蛋白纳米载体靶向髓系细胞递送 HDAC 抑制剂，可稳定成熟斑块，规避广谱 HDAC 抑制剂的全身毒性。

✅临床转化意义

靶点优势：HDAC9只靶向NLRP3通路，不干扰AIM2、NLRC4等其他炎症小体，理论上相比IL‑1β阻断剂，对机体抗感染免疫的影响更小，感染副作用风险更低；

治疗策略：提出“髓系靶向HDAC9抑制”作为动脉粥样硬化新型免疫治疗策略，纳米生物制剂为靶向给药提供概念验证；

生物标志物：人颈动脉斑块HDAC9表达水平和斑块不稳定、临床脑血管事件相关，具备成为斑块风险分层标志物潜力。

ProcartaPlex™ Mouse Th1/Th2 Cytokine & Chemokine Panel 1, 20plex

货号 EPX200-26090-901

靶标列表 [微珠区域]：

• Th1/Th2: GM-CSF [42], IFN gamma [38], IL-1 beta [19], IL-2 [20], IL-4 [26], IL-5 [27], IL-6 [28], IL-12p70 [39], IL-13 [35], IL-18 [66], TNF alpha [45]

• Chemokines: Eotaxin (CCL11) [62], GRO alpha (CXCL1) [43], IP-10 (CXCL10) [22], MCP-1 (CCL2) [51], MCP-3 (CCL7) [48], MIP-1 alpha (CCL3) [47], MIP-1 beta (CCL4) [72], MIP-2 [55], RANTES (CCL5) [44]