ProcartaPlex高分文献分享|具有野生来源微生物群的实验小鼠群体中的自然免疫应答研究

发表时间：2026-01-20 14:39作者：市场部

研究背景

自由生活的哺乳动物携带与宿主共进化的复杂微生物群，这类微生物群对免疫系统的影响涉及多个器官和多种疾病。常规SPF实验室小鼠缺乏野生同类的多数共生菌，未接触自然病原体，免疫反应仅相当于人类新生儿水平，限制了转化研究的价值。虽已有将野生小鼠微生物群转移到实验室小鼠的相关尝试，但复杂微生物群及诱导的免疫表型在实验室环境中的长期稳定性尚不明确。

研究目的

评估野生来源微生物群和免疫表型在实验室小鼠群体中的长期稳定性。
明确野生化小鼠免疫表型的关键特征及可传递性。
验证含野生来源微生物群的小鼠群体作为基础和临床前研究共享资源的可行性。

研究方法

动物模型构建：通过将C57BL/6胚胎移植到假孕野生小鼠体内，建立携带野生微生物群和病原体的野生化小鼠群体。
微生物群分析：采用16S rRNA基因测序和ITS靶向测序，结 PCA、α多样性分析等方法，检测粪便样本中细菌和真菌群组成。
病原体筛查：通过实时PCR检测粪便和皮肤拭子中的病原体，血清抗体检测辅助确认感染状态。
免疫表型分析：运用流式细胞术分析多个器官中免疫细胞的数量、表型及功能，包括细胞活化标志物表达、细胞因子产生等。
临床前模型验证：通过注射CD28超激动剂抗体和LPS，观察小鼠的免疫反应和生存情况。
传递实验：设计交叉抚育和共饲养实验，探究免疫表型的诱导和传递窗口。

研究内容

为了能够频繁地深入监测肠道微生物区系，定期收集并冷冻保存粪便颗粒，用于16S rRNA测序。我们报道了2019年至2023年收集的203只野鼠(雌雄)粪便样本的16S rRNA基因图谱结果，并与153只相同遗传背景(C57BL/6Tac)的性别匹配的实验室小鼠的粪便样本进行了比较。通过此方法监测野生化小鼠（Wildling mice）群体5年间肠道细菌菌群的丰富度、α多样性及组成变化（图1）。跟踪了野生种群粪便样本的细菌组成，重点关注Akkermansia muciniphila 等特定菌群的动态波动（图2）。

图1.在C57BL/6小鼠群体中，野生来源的细菌肠道微生物群保持了其丰富度和α多样性。对野生小鼠群体的粪便样本(雌性，n=17[2019年]，n=13[2020年]，n=33[2021年]，n=30[2022年]，n=36[2023年])进行了16SRRNA基因图谱分析；雄性，n=7[2019年]，n=9[2021]，n=30[2022]，n=16[2023])与常规实验室小鼠的粪便样本(雌性C57BL/6NTac，n=17[2019]，n=9[2020]，n=14[2021]，n=13[2022]，n=14[2023]；雄性C57BL/6NTac，n=7[2019年]，n=6[2021]，n=27[2022]，n=12[2023])进行比较。(A)最后已知分类群的主成分分析(LKT)，基于≥中70%的重叠群50%的样本，经归一化和log2变换，并应用Bray相异度指数。省略号表示90%的置信度区域。(B和C)Chao1(B)和逆Simpsonα多样性指数(C)。(D-G)门(D和E)和科(F和G)的相对丰度。每个条形表示在指定的收集时间点(D和F)来自单个小鼠的粪便颗粒的16S rRNA基因图谱数据。门(E)级和科(G)级个体类群的相对丰度分别表示为野鼠和实验室小鼠粪便样本的平均值。

图2.在粘液阿克曼氏菌(A和B)在门(A)和科(B)的相对丰度暂时扩大后，野生动物群体的肠道细菌微生物群恢复到原来的组成。BAR代表指定采集点野鼠(n=203)和常规实验鼠(n=153)粪便颗粒的16S rRNA基因图谱数据。(C和D)火山图显示野鼠LKT级别的相对丰度与实验室鼠相比有显著差异(C)，以及野鼠群体内LKT相对丰度随时间的变化(D)。X轴显示平均log2倍的变化，右侧(红色)表示增加2倍或更多，左侧(蓝色)表示LKT(参数非配对t检验)减少2倍或更多。(E)显示2019年每个指定时间点野鼠种群相对丰度变化的LKT数量与基准时间点的汇总图表。红色条表示数量增加的LKT，蓝色条表示相对丰度减少的LKT数量，圆圈表示与2019年基线时间点相比，野鼠粪便样本中粘液阿克曼原虫相对丰度的平均倍数变化。2023年分为2月至4月(2日至4日)和5月至9月(5日至9日)两个时期。(F)在两个独立的野生亚群中，粘液阿克曼斯虫的相对丰度自发减少。

对258个粪便小球和237个皮肤拭子进行了病原体检测，并对5年来收集的188个血清样本进行了抗体检测，以研究野生化小鼠体内野生来源病原体和寄生虫的携带情况。并通过定向测序来评估肠道真菌生物群的组成与多样性（图3）。

图3.野生小鼠群体含有野生来源的病原体和寄生虫(A和B)热图显示了在标准动物设施中，通过对粪便颗粒进行实时聚合酶链式反应或对螨类，皮肤拭子(A)和血清抗体分析(B)检测出细菌、寄生虫和病毒阳性的野生小鼠的百分比(2018年：23个血液和23个粪便样本，23个棉签；2019年：每个血液和23个粪便样本和拭子；2020年：117个血液和122个粪便样本，117个棉签；2021年：16个血液和42个粪便样本，35个棉签；2022年：16个血液和31个粪便样本，27个棉签；2023年：6个血液和17个粪便样本，12个棉签)。X表示没有对任何样品进行测试。(C-F)在具有代表性的时间点(2022年)对野鼠(n=6)和实验室鼠(n=6)的粪便真菌生物群进行定向测序。显示了粪便颗粒中真菌DNA量(C)、物种水平的真菌群落组成(D)、LKT水平的相对丰度(E)和α多样性(F)。

为了评估微生物区系和病原体对免疫系统的影响，用流式细胞术对具有代表性的淋巴(脾)和非淋巴器官(肺和肝脏)的淋巴和髓系细胞进行分析，包括分析野生化小鼠淋巴样和髓样细胞群体在脾、肺、肝等器官的数量、活化状态及功能差异（图4），自然杀伤(NK)细胞、B细胞和T细胞作为野生鼠和实验鼠的脾和肺中的主要免疫细胞群（图5）。

图4.野鼠的脾、肺和肝脏的CD45+细胞团的扩展髓系细胞室(A)统一的流形近似和投影(UMAP)可视化，用颜色指示基于手动门控的细胞类型。数据来自具有代表性的时间点(2021年)。(B)野鼠(n=160)和实验鼠(n=153)全脾中淋巴样细胞和髓样细胞的数量。数据汇集自33个独立实验(2019年至2023年)。根据图S1中的门控策略，使用流式细胞仪计算绝对细胞数。(C)多个检测时间点野鼠全脾、肺和肝脏中淋巴样细胞和髓样细胞的数量(上)和频率(下)。与实验室小鼠的相应数据相比，数据显示出倍数差异。X表示没有对任何样品进行测试。脾脏资料：42只独立实验的20只实验鼠(10只雌性，10只雄性)和223只野鼠(160只雌性，63只雄性)；肺部资料：12只雌性小鼠和2只雄性独立实验小鼠共19只(雌性9只)和62只(雌性52只，雄性10只)；肝脏数据来自5个独立实验的20只雌性实验鼠和20只雌性野鼠，雄性小鼠的肝脏没有被研究。

图5.野鼠增强了NK和B细胞的激活和功能(A和B)。在野鼠和常规实验小鼠的脾和肺中，CD27−CD11b+NK细胞(A)和KLRG1CD11b+成熟NK细胞(B)在CD45+B220−CD3CD3NK1.1+NK细胞群中具有代表性的流式细胞术图谱和频率(B)。象限百分比表示。数据来自2-4个独立的实验。(C)脾NK细胞体外颗粒酶B和穿孔素的表达(C)，脾NK细胞CD107a+和/或干扰素-γ+的频率。这些数据代表了4个独立的实验。(E和F)野鼠和正常小鼠脾中CD2 3+CD2 1+−滤泡性B细胞和CD2 3−CD2 1+边缘区B细胞(E)，以及CD4 5+B2 2 0+CD19+B细胞中Fas+Gl7+生发中心B细胞、B2 2 0−CD138+浆细胞和CD19+CD2 7+记忆性B细胞(F)的代表性图谱和频率。选通单元的百分比以点图表示(从2021年开始的数据)。这些数据代表了12个独立的实验。(G)所示类别转换的B细胞亚群中免疫球蛋白G(Ig G)2b+B细胞的代表性直方图和频率。与同一实验中研究的实验室小鼠的数据相比，野生动物的数据显示出倍数的差异。数据汇集自2-5个实验。(H)在具有代表性的时间点(2022年)对血清中免疫球蛋白同种类型进行定量。

通过ProcartaPlex细胞因子检测（Antibody Isotyping 7-Plex Mouse ProcartaPlex™ Panel 2，货号：EPX070-20816-901），使用小鼠血浆与包被特异性抗体(IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgA、IgE、IgM)的磁珠孵育，再与检测微球孵育，通过绘制标准浓度与平均荧光强度来计算抗体浓度。以评估野鼠免疫表型随时间的稳定性，并确定导致野鼠炎症反应增加的免疫细胞群，以验证野生化小鼠在CD28超激动剂抗体和LPS诱导内毒素血症两种临床前模型中免疫反应的稳定性（图6）。

图6.野鼠细胞因子反应增强，可作为临床前模型(A)中稳定的读数，包括基于−和CD62L染色的Foxp3CD4+T细胞和CD8+T细胞。数据来自45个独立实验(脾)和5个独立实验(肺)。象限百分比显示在流式细胞仪的曲线图中。(B)PMA/离子霉素刺激后表达细胞因子Foxp3、−、CD4+和CD8+T细胞的频率。(C)野化群体中临床前模型的稳定性。CD28超激动剂(CD28SA)或模拟注射后4天(4dpi)，野鼠(模拟注射，n=21只；CD28SA治疗，n=8只[2019，两次实验]，33只[2020，八次实验]，44只[2021，11次实验]，8只[2022，两次实验]，7只[2023，两次实验])和实验室小鼠(CD28SA注射，n=20)，野鼠和普通实验小鼠脾中Foxp3+CD4+Tregs的频率(流式细胞术)和数量(曲线图)。模拟注射，n=20，数据来源于5个独立实验)。灰色阴影区域的上限表示CD28SA处理的实验室小鼠中Tregs的平均数量。(D)CD28SA或模型组小鼠(每组5只)腹腔注射CD28SA后2 h，观察小鼠脾淋巴细胞和髓系细胞的细胞因子反应。(E)以67 mg/kg脂多糖(LPS)作为内毒素血症模型后，雌性野鼠和实验鼠的Kaplan-Meier存活曲线。在内毒素注射前6h，腹腔注射抗肿瘤坏死因子-α抗体或同型对照抗体。

设计交叉抚育和共饲养实验，以研究交叉抚育和共饲养对野生化小鼠免疫表型传递的作用（图7）。

图7.野鼠的免疫表型是在出生后获得的，并可以通过交叉培养和共住转移到实验室小鼠。

(A)实验设计。野鼠幼鼠于胚胎第19天(E19)剖腹产下，由实验小鼠饲养场饲养。

(B)通过剖腹产并由实验室小鼠母鼠培育的野生小鼠脾中指定细胞种群的大小(“培育的”)。“野人”指的是由野生水坝饲养的野性幼崽。(C)成年小鼠腹腔注射CD28超激动剂(CD28SA)后4d(4dpi)或模拟对照组：野鼠饲养的实验鼠幼鼠和实验小鼠饲养的野鼠幼鼠(C)，早期与野鼠共居4周(2~6周龄)或8周(2~8周龄)(D)的成年小鼠脾Foxp3+CD4+Treg细胞的频率和绝对数量(C)；成年共居2周(11~13周龄)、4周(9~13周龄)、8周(5~13周龄)(E)。数据来源于2-3个独立实验。(F和G)早期共居4周(2-6周)的实验鼠和野鼠的脾中髓系细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞的数量以及CD_4~+CD_4~+和CD_8~+T细胞的频率，以及生发中心B细胞和产生干扰素-γ的CD_8+T细胞在共居8周(第2~8周)(F)或成年后2周(11~13周)、4周(9~13周)，或8周(5~13周龄)(G)。

研究总结

野生化小鼠肠道细菌菌群的丰富度和α多样性长期高于实验室小鼠，且具有弹性，短暂波动后可恢复原始组成。
野生化小鼠髓样细胞群体扩大，NK细胞、B细胞和T细胞的活化及功能增强，该免疫表型不受饲养条件和特定菌群短暂变化影响。
野生化小鼠在两种临床前模型中表现出稳定的免疫反应，能更好地模拟人类免疫特征。
野生化小鼠的免疫表型需出生后接触自然微生物群获得，且可通过交叉抚育或共饲养传递给实验室小鼠，成年小鼠也可通过共饲养获得该表型。
含野生来源微生物群的C57BL/6小鼠群体可长期稳定维持，为免疫机制研究和临床前实验提供了更可靠的共享资源。

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