Human IFN ELISpot

Human IFN-γ ELISpot操作指导

A. 准备和预包被板的封闭（无菌操作）

1． 从密封的包装袋中拿出ELISpot板，用无菌PBS洗4次（200?l/孔）。

2． 用10%血清的完全培养基封闭（200?l/孔），室温孵育30分钟。

B. 细胞的孵育（无菌操作）

1． 倒掉培养基，加入细胞悬液并加入刺激因子，如抗原（终体积100-150?l/孔）。用mAb CD3-2 为阳性对照。

2． 把板子放到37℃ 5%CO2培养箱孵育12-48小时。在此过程中不要移动板子，并用铝箔纸包上板子以避免边缘效应。 C. 斑点的检测 1． 倒掉细胞，用PBS洗5次（200?l/孔）。 2． 用0.5%胎牛血清的PBS稀释检测抗体为1?g/ml，每孔加入100?l室温孵育2小时。

3． 洗板5次。

4． 用0.5%胎牛血清的PBS 1:1000稀释链霉亲和素，每孔加入100?l室温孵育1小时。

5． 洗板5次。

6． 通过0.45?m过滤器过滤底物（BCIP/NBT），每孔加入100?l，等待清晰的斑点形成。

7． 用自来水冲洗停止显色，冲洗板子的后面。

8． 晾干板子。在显微镜下或用ELISpot计数仪对斑点计数。

9． 室温避光储存板子。注意：如果是未包被的板子，在使用之前需要包被抗体，包被过程为：

1． 用无菌PH7.4 PBS稀释包被抗体浓度为15?g/ml。

2． 从密封的包装袋中拿出ELISpot板，每孔加入50?l 70%乙醇预湿。预湿时间不要超过2分钟。

3． 晃动板子尽快吹干，用无菌水洗5次，200?l/孔。

4． 每孔加入100?l抗体溶液，4℃过夜。