Flowcytoxmix

Flowcytomix 中文操作参考步骤

eBioscience Bender FlowCytomix 操作指南

以Flowcytomix multiplex kit ¬——human Th1/Th2 11plex为例(cat.no. BMS810FF)。( human IFN-gamma, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 p70, TNF-alpha 和TNF-beta)

试剂:
1. 微球及缓冲液
1) cytokines capture beads,抗体包被的微球时间长了会有沉淀,用前斡旋混匀3-5秒。
2) Setup Beads 1瓶 (SB) 。
3) Assay Buffer 1瓶(AB)(10×,50ml)。
4) Reagent Dilution Buffer (RDB)1瓶 13ml。

2. 抗体及标准试剂
1) 1瓶Streptavidin-PE 二抗(200ul):PE标记的抗生物素抗体。
2) 11瓶biotin-conjugate 抗体(20×;350ul),
3) 22瓶Standards (C):每种因子有2瓶,为冻干粉400ng/ml,包含了冻干的人重组蛋白,每个瓶用去离子水稀释准备母液标准品。重悬之后,在2~8℃稳定,12小时内使用。

实验前准备:
1. 准备因子标准品:
1) 打开每瓶冻干粉的炎症因子标准品,加入一定量(瓶身有说明)的去离子水溶解重悬,11种标准品分别取10μL加到90μL的Assay Buffer中充分混匀,标记上"S1"(1:20)。
2) 在梯度倍比稀释之前,先使得溶解的S1保持均衡15分钟。只能用枪微混匀,不能vortex及剧烈吸取。
3) 标记用于梯度稀释的流式管S2~S7,标记后每管加入100uL的Assay Buffer(AB)
4) 梯度稀释:从母液中吸取50uL的稀释液加入标记S2的稀释管中,混匀组分,打掉枪头,然后从S2中再吸取50uL加入S3管中,打掉枪头,再次混匀,再从中吸取50μL加入S4管,混匀,打掉枪头,从S4中再吸取50uL加入下一管。依次进行至S7。

 

2. 准备因子捕获微球
1) 计算试验管的数目:包括标准品、样品、设定和对照管
例:8个血清样本,7个标准稀释液,1个阴性对照,1个设定管,共17个管。考虑每次可能产生气泡等损失,因此,多算3个管,即20个
标准品管数+血清标本数+3=总管数
2) vortex每一个捕获微球悬液管数秒。
3) 混合微球悬液:
每个试验管加入25uL混合微球悬液,如20次试验管,则V=20×25μL=500μL,每种微球加V的1/20(也就是25μL)标记"mixed captured beads",RDB定容至V。
4) 3000g离心5min,小心吸走上清450μL,留50ul。
5) 加入450ul RDB,斡旋混匀5s。混匀的捕获微球现在准备转移到试验管中(每个试验管中加入25ul的混匀微球)

3. 准备biotin-conjugate 抗体和streptavidin-PE
预计每管加50ul。故按照捕获微球量方法进行计算(同上)。

4. 准备实验血清/血浆标本
稀释样本,1:2或1:10或1:100或1:250(根据预实验结果选择)

★实验流程:
1. 准备assay buffer(把10稀释为1×)
2. 按照软件计算结果(如图)准备抗生物素抗体混合物(Biotin-Conjugate 抗体),捕获微球混合物(Beads Mixture)和标准品混合物(standard Mixture)。

 

3. 吸取25μL稀释后的标准品到S1-7号管中(按照标准品的倍比稀释后的,准备两套,加一管S1)。
4. 向2个空白管中加25μL 1×Assay Buffer。
5. 向设定管中加25ul的S1,其余管加样品25ul。
6. 向所有管中加25ul Beads Mixture和50ul biotin-conjugate 抗体,充分混匀,室温避光孵育2h,加1ml 1×Assay Buffer,200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul,重复一次。
7. 加50ul PE-conjugate 抗体 室温避光孵育1h,加1ml 1×Assay Buffer,200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul,重复一次。
8. 每管加500ul 1×Assay Buffer 混匀,上机检测。(流式分析之前,混匀每个样本3-5秒)。

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