细胞凋亡

PI单染检测细胞周期

原理:
碘化丙啶(Propidium ,简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光,并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定,然后根据DNA含量的分布情况,可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

操作步骤:
1、对于悬浮细胞,直接离心收集细胞,弃上清,在4 ℃、1200rmp下用预冷的PBS洗细胞两次;对于贴壁细胞,先用不含EDTA的0.25%的胰酶消化再离心收集细胞;
2、加入预冷的70%乙醇(PBS配制),于4℃固定过夜,或-20℃长期固定;
3、离心收集细胞,以1 mL预冷的PBS洗细胞一次,加入预冷的 PBS重悬细胞,调整细胞浓度为1.0×106,取出100 ul细胞悬液,加入RNase A酶,使RNase A终浓度为1 mg/ml,混匀后37 ℃水浴30 min;
4、加入PI综合染色液,使PI终浓度为50 ug/mL,混匀,4℃冰箱避光保存;
5、300目尼龙网过滤后,上机检测。

注意事项:
1、细胞浓度一定要≧1×106/ml,特别是阴性对照管细胞量要大一些,以便样品电压调节;
2、必须保证被检测样品为单细胞悬液;
3、如果样品细胞为培养的贴壁细胞,将上清转入离心管(其中含有脱落的凋亡细胞),与不含EDTA的胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞;
4、在细胞固定时一定要将细胞吹开,吹成单细胞悬液;
5、RNAse与PI综合染液分开的原因是RNAse的作用最适温度是37℃,而不是4℃,所以与教材有所不同;
6、PI综合染液不能用蒸馏水配,否则细胞全部溶解,造成结果不可靠;
7、4℃过夜一般隔天就进行检测,如果想推迟几天测,那就保存在-20℃,有资料显示-20℃可以至少保存一个月;
8、70%~75%的酒精都可以用于PI单染固定。

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